植物葉片是吸收陽光的場所，而葉片中葉綠素的含量高低，又決定了光合速率。植物葉片中葉綠素含量高，則光合作用更加快速，植物營養(yǎng)狀況更加全面。事實上，通常我們測定測定葉綠素含量以表征植物生長狀況, 也往往把葉色變化作為看苗診斷和肥水管理的重要指標(biāo)。而測定植物葉綠素含量又有幾種方法：分光光度法、葉綠素測定儀、光聲光譜法等。分光光度法是應(yīng)用最為廣泛的一種方法，但同為分光光度法，也有不同的試劑作為溶劑，使的葉綠素含量的測定結(jié)果有少許差異。本文主要講解下用丙酮-乙醇混合法提取葉綠素。

具體實驗操作：

1.儀器與試劑：分光光度計、高度電動勻漿器、電子天平；珊瑚樹嫩葉、95% 丙酮-乙醇、95%乙醇和80%丙酮。（如果需要作對比實驗，可以使用葉綠素含量測定儀或者SPAD502葉綠素儀來進行測定，）

2.實驗方法：葉綠素的提取: 將材料去脈剪碎(約1—2mm 見方) , 隨機取樣, 準(zhǔn)確稱重取015g (精確到0.1mg) , 放入50mL 比色管中, 分別加入上述三種提取液25mL; 另稱0.5g 樣品, 加6mL 雙蒸水和少量CaCO3, 勻漿, 定容至25mL , 過濾, 取2.25mL 濾液放入50mL 比色管中, 加23.75mL 丙酮-乙醇(2∶1) , 使之成為95% 丙酮2乙醇勻槳提取液。比色管加塞放置于25℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)暗中提取葉綠素。每種提取方法重復(fù)3 次。

葉綠素提取液吸收光譜的測定: 用分光光度計在600—700nm 范圍內(nèi)對不同葉綠素提取液進行掃描, 波長精度為0.2nm。

葉綠素含量測定: 分別以提取溶劑作空白, 測定葉綠素提取液吸光度A 645、A 663, 利用A rnon 公式:

葉綠素a 濃度(mgöL ) : Ca= 12. 7A 663- 2. 69A 645;

葉綠素b 濃度(mgöL ) : Cb= 22. 9A 645- 4. 68A 663;

葉綠素總濃度(mgöL ) : Ca+ b= Ca+ Cb。

計算提取液中葉綠素濃度, 換算為每克鮮葉葉綠素含量(mg/g 鮮重)。

3.結(jié)果與討論

（1）葉綠素提取液的吸收光譜：4 種葉綠素提取液的吸收光譜在600—700nm 范圍內(nèi)基本相似, 說明4 種葉綠素提取液的光吸收性質(zhì)基本相似, 可以用A rnon 公式進行葉綠素含量的計算。

（2）不同提取溶劑對葉綠素提取總量的影響：不同提取溶劑對葉綠素提取總量有著明顯的影響(表1) , 95% 丙酮2乙醇提取的葉綠素總量最高, 高于傳統(tǒng)的80% 丙酮提取法29.5% ,95% 乙醇提取的葉綠素總量亦比80% 丙酮法高9.5%。95% 丙酮2乙醇提取葉片勻漿的葉綠素總量與提取葉片碎片的葉綠素總量沒有顯著差異。

（3）不同提取溶劑提取葉綠素的進程：不同提取溶劑提取葉綠素速度差異較大, 提取完全程度也不同。提取速度最快的是95%丙酮2乙醇, 葉綠素經(jīng)過8h 已經(jīng)基本提取完全, 葉片碎片變白; 其次是95% 乙醇, 而80% 丙酮提取速度最慢, 后兩者在24h 內(nèi)沒有完全提取出葉綠素。從提取速度來看, 95% 丙酮2乙醇要優(yōu)于95%乙醇和80% 丙酮。葉片勻漿后用95% 丙酮2乙醇在0.5h 就已經(jīng)提取完全, 大大加快了葉綠素提取速度。

（4）不同提取液中葉綠素的穩(wěn)定性：用不同提取溶劑提取珊瑚樹葉片葉綠素, 在25℃生化培養(yǎng)箱中暗中放置0、3、6 天后測定提取液中葉綠素含量, 結(jié)果見表2。葉綠素提取液放置6 天后, 葉綠素a 下降了5.8% —11.9% , 葉綠素b下降了2.7% —7.4% , 葉綠素總量下降了4.9% —10.5%。這些都說明, 在這些提取液中, 葉綠素b比葉綠素a 穩(wěn)定。葉綠素提取液中葉綠素a、葉綠素b 的含量、穩(wěn)定性與提取材料、提取液性質(zhì)和提取液含水量有關(guān)。為了提高葉綠素提取液的穩(wěn)定性, 可通過降低提取液中的含水量來實現(xiàn)。但若所用的材料是干粉, 提取液中最好含有適量的水分, 使葉綠素分子中親水的基因易與蛋白質(zhì)分離,利于葉綠素從類囊體膜中游離出來。有些學(xué)者曾采用比傳統(tǒng)丙酮法含水量更低的丙酮提取液提取鮮葉葉綠素, 效果較好。本試驗結(jié)果表明, 葉綠素在不同提取液中穩(wěn)定性的大小依次為: 95% 丙酮2乙醇> 95%乙醇> 80%丙酮。

（5）精密度實驗：95% 丙酮-乙醇提取效果好, 提取速度快, 具有較高的精密度。

4.結(jié)論

分光光度法測定植物葉片葉綠素含量, 由于所用提取溶劑不同, 測定結(jié)果差異顯著。一種好的提取溶劑應(yīng)該提取速度快, 葉綠素得率高, 穩(wěn)定性好, 測定結(jié)果精密度高, 吸收光譜與傳統(tǒng)丙酮法一致, 能用A rnon 公式計算葉綠素含量。本試驗結(jié)果表明, 95% 丙酮2乙醇法具有上述特點, 是一種較好的葉綠素提取溶劑, 而傳統(tǒng)的80% 丙酮法和95% 乙醇法提取葉綠素速度慢, 提取不完全, 應(yīng)慎用。葉片經(jīng)勻漿后再用丙酮2乙醇提取, 葉綠素得率與葉片浸泡法相似, 但大大提高了提取速度, 這對于快速測定大量樣品葉綠素含量具有實際意義。